无菌医疗器械生产质量体“初始污染菌和微粒污染的控制”
《医疗器械生产质量管理规范无菌医疗器械现场检查指导原则》中8.10.1中提到“应当根据产品质量要求确定产品的初始污染菌和微粒污染的控制水平并形成文件，明确中间品的存储环境要求和存放时间，按文件要求定期检测并保持相关记录”。
无菌医疗器械生产质量体系应该怎么满足呢？
归口部门 | 技术质量部 | 持有部门 | 技术质量部 | 受控状态 | |
发布日期 | 实施日期 | ||||
编制 | 审核 | ||||
批准 | 发放日期 |
1、概述
对产品及初包装不溶性微粒污染检测方法做出指导，正确操作以保证实验结果的可靠性和准确性。
2、范围
适应于检测产品及初包装袋上的不溶性微粒污染的检测。
3、周期
3.1同品种产品每月至少进行一次不溶性微粒污染检测。
3.2初包装袋每批次进货检验应进行不溶性微粒污染检测。
4、职责
品管部负责产品及初包装不溶性微粒污染的检测。
5、依据
《中华人民共和国药典 四部》（2020 版）通则 0903 不溶性微粒检查法第二法 （显微计数法）。
6、程序
6.1仪器试液及其要求
6.1.1仪器试液：洁净工作台、显微镜、微孔滤膜及其滤器、平皿、蒸馏水等。
6.1.2仪器要求
洁净工作台：高效空气过滤器孔径为0.45㎜，气流方向由里向外。
显微镜：双筒大视野显微镜，目镜内附标定的测微尺(每格 5～10μm)。坐标轴前后、左右移动范围均应大于30㎜ ,显微镜装置内附有光线投射角度、光强度均可调节的照明装置。检测时放大 100 倍。
微孔滤膜：孔径0.45μm、直径25㎜ 或13㎜，一面印有间隔3㎜ 的格栅；膜上如有10μm及 10μm以上的不溶性微粒， 应在5粒以下， 并不得有25μm及 25μm以上的微粒， 必要时，可用微粒检査用水冲洗使符合要求。
蒸馏水：用孔径 0.2μm的微孔滤膜过滤。
6.2供试液制备
6.2.1产品供试液
6.2.1.1管路类产品：随机抽取3 套产品，分别用0.2μ m 滤膜过滤后的蒸馏水500ml，充分冲洗内腔，并收集冲洗液，作为供试液。
6.2.1.2非管路类产品：随机抽取3 套产品，分别完全浸于0.2μ m 滤膜过滤后的蒸馏水500ml中，浸提，收集浸提液，作为供试液。
6.2.2 初包装袋供试液： 随机抽取3只初包装袋，袋内分别注入0.2μ m 滤膜过滤后的蒸馏水，用 500ml 蒸馏水充分的冲洗初包装袋内部，并收集冲洗液，作为供试液。
6.2.3要求
6.2.3.1环境要求： 所有制备过程均在万级背景下局部百级洁净环境下进行（即万级洁净间的超净工作台）。
6.2.3.2容器：收集容器及浸提容器须经过0.2μ m 滤膜过滤后的蒸馏水充分洗涤。
6.3试验方法
6.3.1取 0.45μm的微孔滤膜，安装于经 0.2μm滤膜过滤后蒸馏水清洗后的抽滤系统中，并用经 0.2μ m 滤膜过滤后的蒸馏水对系统进行充分冲洗。
6.3.2取相应供试液 1ml，用0.2μm滤膜过滤后蒸馏水稀释至100ml，进行充分抽滤，取出滤膜。
6.3.3将滤膜抽滤面朝上，在显微镜放大100倍条件下，对微粒进行计数。
6.3.4平行试验，按照相同方法进行，计算平均值。
6.3.5要求：所有试验操作均在在万级背景下局部百级洁净环境下进行（即万级洁净间的超净工作台）。
6.4结果判定
6.4.1管路类：每1ml供试液中含10μm及10μm以上的微粒数不得过20粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过5粒。
6.4.2非管路类：每lml浸提液中含10μm及10μm以上的微粒数不得过30粒，含25μm及 25μm以上的微粒数不得过10 粒。
6.4.3初包装袋：每1ml浸提液中含10μm及10μm以上的微粒数不得过30粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过10粒。
6.5无菌产品及初包装袋贮存要求
6.5.1产品：无菌产品初包装前所有零配件均应存放于10 万级洁净车间，且置于周转箱中， 加盖贮存。
6.5.2初包装袋：初包装袋进入洁净车间或经使用后剩余的包装袋，放于原内袋中，并扎口放于周转箱中，加盖贮存；如需退库，将初包装袋在洁净车间内双层密封包装且标识清晰后通过物流通道传出。
初始污染菌检验规程
1、准备工作
1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.
3）检测标准：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：
1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：
1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：鲁械咨询 审核： 鲁械技术 批准：鲁械注准
初始污染菌和微粒污染控制验证方案
验证报告编号：QT-CF-BG-01
起草人: 鲁械咨询代办医疗器械注册 日期：2020年8月3日
审核人： 鲁械技术 日期：2020年8月10日
批准人： 鲁械注准 日期：2020年8月12日
1.目的
通过设计试验确认无菌手术包半成品的储存环境和存放有效期。其可能存在的环节如下：
（1）在内包装封口前初始污染菌是否满足控制要求（定期监控）；
（2）等待灭菌的产品，密封严实存放在外包间，其初始污染菌随储存时间变化。
2.适用范围
本验证方案适用于本产品，通过试验研究，以确定在各种情况下的储存有效期。
3.发放范围
管理者代表、生产部和质量部等有关部门及人员。
4.规范性引用文件
《中华人民共和国药典》2020版 附录 微生物限度检查法
5. 组织和职责
根据验证工作量的大小，本公司成立验证组，由公司管理者代表任组长，生产部、质量部、有关部门及人员任组员。验证小组职责：
负责验证方案的起草、批准；
负责验证的协调工作，以保证验证方案规定项目的顺利实施；
负责验证数据结果的审核；
负责验证报告的审批；
负责发放验证证书；
负责确定该项验证的再验证周期。
5.1 主责部门
本方案的主责部门为公司管理者代表，其职责为:负责审批验证方案和验证报告，颁发验证证书。
5.2 相关部门
本方案的相关部门为质量部，其职责为：按标准操作规程及验证方案进行各项确认，及时报告确认结果，形成验证报告；负责操作培训和现场监督。
6.步骤和方法
6.1计划及进度
本验证由质量部提出完整的验证计划，经验证小组批准后实施，由质量部完成，整个验证活动分为两个阶段完成：
运行确认(OQ) 从 年 月 日到 年 月 日
性能确认(PQ) 从 年 月 日到 年 月 日
6.2 初始污染菌和微粒检测方法及可接受标准
6.2.1抽样方法和抽样规律
以每一个生产批为产品抽样批，随机抽取样品1支（长宽约30×2cm）记为1单位，在洁净条件下精确称重，并标记。
需要临时或长期存放时间预计不超过30天（1个月），综合细菌的生长规律及可能存在的存放天数，其抽样检测的时间设计为存入后：第1天、第2天、第3天、第5天、第7天、第15天、第30天。
6.2.2 供试液制备
1) 取0.9%的生理盐水溶液10ml，盛于已灭菌的试管内；
2) 将取样依次投入试管，充分摇匀。
6.2.3接种与培养
1) 取上述供试液1ml加入9ml生理盐水溶液，稀释成1:10；取上述稀释液2ml，分别注入2个已灭菌的平皿内(每个平皿注入1 ml)；
2) 同时取1ml加入盛有9ml生理盐水溶液的试管中，稀释成1：100，再取此稀释液2ml，分别注入2个已灭菌平皿内(每个平皿注入1 ml)；
3) 用已灭菌的营养琼脂培养基，融化待冷却到40-50℃，分别倾注15ml上述4个平皿，盖好上盖，并以顺时针或逆时针方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。
4) 以上平皿做好标记，以免混淆。
5) 待培养基凝固后，将平皿移入37℃的培养箱中培养不少于48±2小时。
6.2.4菌落计数
1) 当菌落数大于300 CFU时，应将原液稀释成1：1000，即取供试液1ml加入0.9%的氯化钠溶液9ml中取得，然后重新接种及培养。
2) 当细菌生长呈片状、花点样菌落，该平皿不以计数。
3) 若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2，以代表全平皿菌落数。
4) 计数方法
平均数值×稀释倍数
菌落数/质量（g）=
质量
a) 首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。
b) 如只有一个稀释级平均菌落数在30～300之间，则菌落数为该稀释级的菌落数乘以稀释倍数。
c) 如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30～300之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。
高稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数
比值=
低稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数
当比值≤2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。当比值＞2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。
d) 如各稀释级平均菌落数均在300以上，则按最高平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按最低平均菌落数乘以稀释倍数报告。
e) 如各稀释级平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。
f) 如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时，应报告菌数为<10个/g。
g) 如有3个稀释级平均菌落数均在30～300之间，则以后2级计算级间比值报告。
h) 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数为“不可计”时，应表明样品的稀释度。
例：
例次 | 不同稀释度的平均菌落数 | 两相邻稀释度菌数之比 | 菌落总数 个/g | 报告方式 个/g | ||
10-1 | 10-2 | 10-3 | ||||
1 | 1365 | 164 | 20 | - | 16400 | 16000或1.6×104 |
2 | 2760 | 295 | 46 | 1.6 | 38000 | 38000或3.8×104 |
3 | 2890 | 271 | 60 | 2.2 | 27100 | 27000或2.7×104 |
4 | 不可计 | 4650 | 513 | - | 513000 | 510000或5.1×105 |
5 | 27 | 11 | 5 | - | 270 | 270或2.7×102 |
i）总稀释倍数计算时应包括取样时的10ml，即已稀释10倍。
6.2.5可接受标准
初始污染菌和微粒控制值：≤100 CFU/单位
6.3 验证内容
6.3.1包装封口前的半成品
生产批号 | 初始污染菌检测均值（CFU/单位） | 结果评价 |
150901 | ||
结论：灭菌前初始污染菌 | ||
主检： 复检： 日期： 年 月 日 | ||
6.3.2等待灭菌的半成品
存放时间 | 初始污染菌检测均值（CFU/单位） | 评价 |
第1天 | ||
第2天 | ||
第3天 | ||
第7天 | ||
第15天 | ||
第30天 | ||
结论：半成品初始污染菌 | ||
主检： 复检： 日期： 年 月 日 | ||
以上记录要三次生产批。
7.批准结论
验证组组长对验证报告进行审查、批准、并出具合格证明（合格验证报告）。
8.再验证周期
a）常规再验证周期一年；
b) 定期对初始污染菌和微粒的检测，定期汇总并进行趋势分析；
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